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Jan 17, 2024

Oxidación simultánea de sulfuro y metano por un extremófilo

Volumen de comunicaciones de la naturaleza

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 2974 (2023) Citar este artículo

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El sulfuro de hidrógeno (H2S) y el metano (CH4) se producen en ambientes anóxicos a través de la reducción de sulfato y la descomposición de la materia orgánica. Ambos gases se difunden hacia las zonas óxicas donde los metanótrofos aeróbicos mitigan las emisiones de CH4 al oxidar este potente gas de efecto invernadero. Aunque los metanótrofos en innumerables entornos se encuentran con H2S tóxico, prácticamente se desconoce cómo se ven afectados. Aquí, a través de un extenso cultivo de quimiostatos, mostramos que un solo microorganismo puede oxidar CH4 y H2S simultáneamente a tasas igualmente altas. Al oxidar el H2S a azufre elemental, el metanótrofo termoacidofílico Methylacidiphilum fumariolicum SolV alivia los efectos inhibidores del H2S sobre la metanotrofia. La cepa SolV se adapta al aumento de H2S mediante la expresión de una oxidasa terminal de tipo ba3 insensible al sulfuro y crece como quimiolitoautótrofo utilizando H2S como única fuente de energía. Los estudios genómicos revelaron enzimas putativas oxidantes de sulfuro en numerosos metanótrofos, lo que sugiere que la oxidación de H2S está mucho más extendida en los metanótrofos de lo que se suponía anteriormente, lo que les permite conectar los ciclos de carbono y azufre de formas novedosas.

El sulfuro de hidrógeno (H2S) es la forma más reducida de azufre (S) y una potente fuente de energía y azufre, tóxico y molécula señalizadora1,2,3. Es un ácido débil que se difunde fácilmente a través de las membranas e inhibe varios procesos, como la respiración aeróbica, al unirse a las citocromo c oxidasas. Además, el H2S1,4,5,6 inhibe severamente otros procesos metabólicos que utilizan enzimas que contienen cobre y hierro. Por lo tanto, los microorganismos que viven en ambientes ricos en sulfuros requieren mecanismos adecuados para detoxificar H2S7,8. En una miríada de entornos, como humedales, sedimentos marinos, suelos, plantas de tratamiento de aguas residuales, lagos, campos de arroz, vertederos y entornos geotérmicos ácidos, el H2S se produce mediante la reducción del sulfato (SO42−), la mineralización de la materia orgánica y la termoquímica8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18.

Al agotarse el sulfato, la materia orgánica finalmente se convierte en metano (CH4) en ecosistemas sin oxígeno9,12,13,19,20,21. Cuando tanto el H2S como el CH4 se difunden en las zonas óxicas superpuestas, el CH4 puede ser utilizado como fuente de energía por las bacterias aeróbicas oxidantes del metano, que se supone que mitigan la mayoría de las emisiones de este potente gas de efecto invernadero22. A pesar de este biofiltro de metano efectivo, anualmente se liberan a la atmósfera de 548 a 736 Tg de CH4 de diversas fuentes naturales y antropogénicas23,24. Los metanótrofos aerobios forman parte de varias clases y familias bacterianas, incluidas las ubicuas Alpha- y Gammaproteobacteria16,25,26, Actinobacteria27 y las extremófilas Methylacidiphilaceae del phylum Verrucomicrobia28,29,30,31. Estas últimas son bacterias acidófilas que comparten un pH óptimo bajo (2,0 − 3,5) y viven entre 35 y 60 °C26,31,32. Todos los metanótrofos verrucomicrobianos conocidos se han aislado de hábitats geotérmicos como fumarolas y lodos, de los cuales se emiten grandes cantidades de CH4 y H2S, en su mayoría termogénicos16,28,33,34,35. Los ambientes geotérmicos se caracterizan típicamente por altas emisiones de H2S y, por lo tanto, los metanótrofos verrucomicrobianos aislados de estos ecosistemas son ejemplos destacados para estudiar cómo los metanótrofos se ven afectados por el H2S.

Cada vez es más claro que los metanótrofos son metabólicamente versátiles y capaces de utilizar fuentes de energía ambientalmente relevantes, como H2, propano, etano, acetato, acetona, 2-propanol y acetol16,36,37,38. La capacidad de utilizar varias fuentes de energía es muy beneficiosa en entornos con emisiones de gases muy fluctuantes. Recientemente, se demostró que los cultivos puros del metanótrofo verrucomicrobiano Methylacidiphilum fumariolicum SolV pueden consumir metanotiol (CH3SH), con la formación subestequiométrica concomitante de H2S, lo que indica que la cepa SolV metabolizó parcialmente el tóxico H2S39. A continuación, un elegante estudio demostró que también los metanótrofos proteobacterianos pueden oxidar H2S40. Los autores aislaron la cepa HY1 de la versátil alfaproteobacteria 'Methylovirgula thiovorans' de una turbera de Corea del Sur que podría crecer en tiosulfato (S2O32-), tetrationato (S4O62-), azufre elemental (S0) y una variedad de compuestos de carbono. Sin embargo, las células de la cepa HY1 cultivadas en CH4 como única fuente de energía no fueron capaces de oxidar H2S, y la oxidación de H2S solo se inició y observó en células cultivadas en presencia de tiosulfato. Además, no se estudió el crecimiento en H2S. Teniendo en cuenta las observaciones recientes, es fundamental investigar si existen microbios que puedan oxidar simultáneamente los gases CH4 y H2S que son relevantes para el medio ambiente, cómo los metanótrofos hacen frente al H2S y si dichos metanótrofos pueden conservar energía y producir biomasa utilizando H2S como fuente de energía.

Aquí, a través del cultivo extensivo de quimiostatos, mostramos por primera vez que un microorganismo puede oxidar CH4 y H2S simultáneamente. M. fumariolicum SolV es inhibido por la presencia de concentraciones elevadas de H2S, pero el H2S se oxida rápidamente a azufre elemental (S0) como mecanismo de desintoxicación para aliviar el efecto inhibidor del H2S sobre la oxidación del CH4. La cepa SolV se adapta al H2S con la regulación al alza de una sulfuro de tipo III: oxidorreductasa de quinona (SQR) y una citocromo c oxidasa de tipo ba3 insensible al H2S, lo que crea una vía de transferencia de electrones del H2S al O2. Además, la cepa SolV incorpora 13CO2 utilizando H2S como única fuente de energía. Proponemos que la capacidad de oxidación de H2S de los metanótrofos verrucomicrobianos es esencial para prosperar en ecosistemas geotérmicos ácidos ricos en azufre. Además, encontramos SQR en una gran cantidad de metanótrofos proteobacterianos de diversos entornos. Teniendo en cuenta que el CH4 y el H2S coexisten en una miríada de ecosistemas con oxígeno limitado, la oxidación del H2S podría ser un rasgo presente entre muchos metanótrofos aeróbicos.

La detección de genes que codifican supuestas sulfuro:quinona oxidorreductasas (SQR) en los genomas de metanótrofos verrucomicrobianos nos llevó a investigar si los metanótrofos pueden oxidarse y adaptarse a H2S16. En consecuencia, se mantuvo un cultivo continuo del metanótrofo aeróbico termoacidofílico Methylacidiphilum fumariolicum SolV (funcionando como quimiostato a una tasa de dilución (D) de 0,016 h−1) con CH4 como fuente de energía y CO2 como fuente de carbono (células no adaptadas; Fig. 1a), hasta una carga de 39 μmol CH4 min−1 · g PS−1 (Tabla 1). A modo de comparación, se diseñó un sistema de cultivo continuo distinto (con una carga de CH4 idéntica) para adaptar las células a cargas crecientes de H2S (Fig. 1 complementaria). Las células que crecían en este quimiostato oxidaron simultáneamente H2S y CH4 (células adaptadas al sulfuro; Fig. 1b), hasta cargas concurrentes de 42 μmol H2S · min−1 · g DW−1 y de 38 μmol CH4 · min−1 · g DW−1 (Tabla 1), mientras que la concentración de H2S en la salida de gas se mantuvo por debajo de 2 nmol · L−1. Los cultivos continuos en estado estacionario de células no adaptadas y adaptadas al sulfuro podrían mantenerse durante muchas generaciones (Fig. 1a, b). La acumulación de azufre elemental (S0) durante semanas de crecimiento fue evidente, a medida que se desarrollaban cantidades crecientes de un precipitado amarillo (partículas microscópicas irregulares) y se unían a las partes metálicas y las paredes del quimiostato (Fig. 2 complementaria). Después de algunas semanas de operación con H2S, se identificó que tenía más del 99 % de azufre puro y la cantidad podría representar al menos el 80 % del sulfuro convertido durante este período. A través del microscopio, solo se pudieron observar cantidades diminutas de partículas de azufre en el líquido en lugar de células bacterianas. Tanto los cultivos no adaptados como los adaptados al sulfuro se operaron en bajas concentraciones de O2 disuelto (1% de saturación de aire) para minimizar la oxidación química del sulfuro. Las bajas concentraciones de O2 también resultaron en la expresión de actividad hidrogenasa como se observó previamente41. Las incubaciones de control en experimentos de espectrometría de masas de entrada de membrana (MIMS) sin células mostraron una oxidación insignificante de sulfuro en concentraciones de rango micromolar.

a Metano oxidante de cultivo continuo. b Cultivo continuo oxidando simultáneamente altas concentraciones de CH4 y H2S. c Cultivo discontinuo alimentado que muestra un aumento en la biomasa de 13C con H2S como única fuente de energía. Los datos se presentan como medias ± desviaciones estándar (n = 3 repeticiones técnicas). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Los metanótrofos verrucomicrobianos poseen el ciclo de Calvin-Benson-Bassham para la fijación de CO242, lo que plantea la cuestión de si pueden crecer como quimiolitoautótrofos en CO2 con H2S como fuente de energía. En consecuencia, se inoculó un reactor de lote alimentado con un cultivo diluido (OD600 = 0,05) del quimiostato dual H2S-CH4 y se complementaron con H2S y 13CO2 como única fuente de energía y carbono, mientras se desconectaba el suministro de CH4. Con el tiempo, la biomasa de las células SolV de M. fumariolicum se enriqueció en carbono-13 al incorporar 13CO2 a la biomasa (Fig. 1c). Cuando se aumentó la carga de H2S, el porcentaje de biomasa de 13C aumentó en consecuencia. El crecimiento fue evidente, ya que un aumento en la biomasa de 13C estuvo acompañado de un aumento en el peso seco (Fig. 3 complementaria). Mediante la cuantificación de H2S en la entrada y salida de gas del reactor, se determinaron eficiencias de conversión de H2S de ~98–100 % durante todo el período de incubación.

Las tasas de consumo de H2S y los efectos inhibidores de H2S en células SolV de M. fumariolicum se midieron dentro de una cámara llena de líquido conectada a un espectrómetro de masas de entrada de membrana (MIMS), que permite la cuantificación simultánea y en tiempo real de múltiples gases, mientras que el O2 fue medido por un punto de sensor. Se midió una tasa máxima de conversión de CH4 de células no adaptadas de 200 ± 11 μmol CH4 · min−1 · g DW−1 con una tasa de consumo de O2 concomitante de 302 ± 9 μmol O2 · min−1 · g DW−1 (Tabla 1). En comparación, para las células adaptadas al sulfuro se midió una tasa máxima de conversión de CH4 y una tasa de consumo de O2 concomitante de 33 y 30 % más bajas, respectivamente. De manera similar, las tasas máximas de respiración de metanol de las células adaptadas al sulfuro fueron un 32% más bajas que las medidas para las células no adaptadas (Tabla 1). Teniendo en cuenta el 1 mol de O2 requerido para la activación de 1 mol de CH4, las tasas máximas de respiración de CH4 de las células no adaptadas y adaptadas al sulfuro fueron aproximadamente 3 veces más bajas en comparación con las tasas máximas de respiración de metanol (Tabla 1), lo que indica la conversión de metano a metanol como paso limitante de la velocidad. Además, presumiblemente debido a la baja concentración de dO2 en los cultivos continuos, las células no adaptadas y adaptadas al sulfuro expresaron una alta actividad hidrogenasa (Tabla 1), con una relación de consumo de H2:O2 medida de ~1:0,35 como se esperaba32, 42. Como fue el caso de la respiración de CH4 y metanol, las tasas máximas de respiración de H2 de las células adaptadas al sulfuro fueron más bajas que las de las células no adaptadas (Tabla 1). Por lo tanto, la ganancia en el aumento de la capacidad de oxidación de H2S en las células adaptadas al sulfuro se produce a expensas de las capacidades de conversión de CH4, metanol y H2.

Las células adaptadas al sulfuro en el quimiostato oxidaron H2S a concentraciones bajas no inhibidoras (Fig. 1b), lo cual es necesario ya que la capacidad de oxidación de CH4 de las células no adaptadas (así como las células adaptadas al sulfuro) se vio afectada por una concentración de H2S tan bajo como 1 μM. La oxidación de CH4 se inhibió en un 25 %, 70–85 % y 95 % en presencia de 2 μM, 4-5 μM y 10 μM de H2S, respectivamente (Fig. 2). La inhibición de la conversión de CH4 pareció ser reversible, ya que cuando se consumió H2S o se eliminó de incubaciones a corto plazo, la conversión de CH4 y la producción de CO2 se reanudaron inmediatamente a sus tasas anteriores. Después de períodos más largos (2 h) de inhibición por H2S 10–20 μM, las tasas de conversión de CH4 fueron un 25–35 % más bajas. No se pudo concluir si estas tasas más bajas fueron el resultado de la inhibición de pMMO u otras partes de la cadena respiratoria, ya que la conversión de metanol (CH3OH) también se vio afectada después de exposiciones tan prolongadas al H2S.

El H2S se mantuvo en varias concentraciones estables (indicadas en la parte inferior) mediante adiciones de H2S en forma de pulsos a la cámara MIMS. Los números indican las tasas de consumo de CH4 en μmol CH4 · min−1 · g DW−1. A los 170 min, la cámara MIMS se ha vuelto anóxica, lo que da como resultado el cese del consumo de CH4. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Se midieron altas tasas iniciales de consumo de O2 cuando solo se administró H2S a células no adaptadas en la cámara MIMS. Curiosamente, estas tasas disminuyeron inmediata y rápidamente ~15 veces en unos pocos minutos a tasas estables de 10 ± 1 μmol O2 · min−1 · g DW−1 (a 40–80 μM H2S y <10 μM O2). Esta rápida disminución en la tasa de respiración indicó la presencia de oxidasas terminales sensibles al sulfuro (SSTO) que se inactivaron rápidamente después de la adición de H2S y al menos un tipo de oxidasa terminal insensible al sulfuro (SITO) responsable de la tasa de respiración baja restante43. La tasa de reacción máxima de SITO (10 ± 1 μmol O2 · min−1 · g DW−1) es limitada, ya que constituye solo el 3% de la tasa de respiración máxima de estas células no adaptadas en metanol (Tabla 1). A concentraciones de O2 10 veces mayores (70–90 µM O2 y 30–80 μM H2S), la tasa de respiración restante aumentó ~40 % (Tabla 1), lo que sugiere que el O2 compite con el H2S por el sitio activo de los SSTO, por lo que aliviar la inhibición de H2S. La actividad de SITO fue sensible al cianuro ya que el 95% de la tasa de respiración se inhibió con cianuro de potasio 1 mM. Las células adaptadas al sulfuro oxidaron H2S con tasas máximas de consumo de O2 de 53 ± 4 μmol O2 · min−1 · g DW−1 (Tabla 1). Dado que a 40–80 μM H2S se asumió que los SSTO estaban completamente inhibidos, estos valores representan las tasas de SITO, que son más de cinco veces más altas en comparación con las células no adaptadas (Tabla 1). El H2S se convierte principalmente en azufre elemental (S0), ya que se determinó una estequiometría de H2S:O2 de 1:0,48 (± 0,005; n = 3) después de la cuantificación simultánea del consumo de H2S y O2, junto con la producción visible de S0 (Fig. 7b).

Las tasas de conversión máximas de H2S a concentraciones bajas (submicromolares) no inhibidoras en la cámara MIMS fueron difíciles de realizar debido a su rápido consumo que resultó en una inhibición variable. Alternativamente, las tasas máximas de conversión de H2S se determinaron en el quimiostato dual H2S-CH4 aumentando gradualmente la carga de sulfuro a 156 μmol H2S · min−1 · g DW−1 en el transcurso de un día mientras se monitoreaba la concentración de salida (Tabla 1) . Este último aumentó de 2 a 25 nmol · L-1 y, por lo tanto, permaneció por debajo de una concentración líquida de 40 nM, que se consideró que no afectaba a pMMO (medido a través de incubaciones MIMS). Sin embargo, la conversión de CH4 disminuyó alrededor del 40% pero se mantuvo estable durante días. Cuando, de manera similar, al quimiostato se le administró solo H2S mientras se desconectaba el CH4, se midió la misma tasa máxima de conversión de H2S de 156 μmol H2S · min−1 · g DW−1. Como la respiración no es el factor limitante en esta configuración (Tabla 1), esta tasa se considera la tasa máxima de conversión de H2S, que es 1,5 veces más alta que la actividad SITO que puede representar en estas células adaptadas al sulfuro y que es posible gracias a los SSTO que se inhibieron sólo parcialmente a estas bajas concentraciones de sulfuro. Se midieron tasas similares para las células adaptadas al sulfuro en la cámara MIMS en presencia de 60–80 μM O2 (Tabla 1). Por lo tanto, a concentraciones bajas de H2S y/o altas de O2, las células muestran las tasas de conversión de sulfuro más altas, ya que los SSTO solo se inhiben parcialmente. Notablemente, la tasa máxima de conversión de H2S medida anteriormente en la cámara MIMS superó la tasa máxima de conversión de CH4 de las celdas adaptadas al sulfuro (Tabla 1).

Tras la adición de metanol durante la respiración de 20–40 μM H2S por células no adaptadas en la cámara MIMS, el consumo de H2S cesó de inmediato (Fig. 3a), pero la tasa de respiración total aumentó ~40 %. Por el contrario, la oxidación de H2S por células adaptadas a sulfuro (que tienen una actividad SITO cinco veces mayor) continuó al 43 % de la tasa cuando se agregó metanol (Fig. 3b), mientras que la tasa de respiración total aumentó ~25 % (Fig. 4 complementaria). ). Por lo tanto, el metanol y el H2S se respiraron simultáneamente y parecen competir por la misma oxidasa terminal. Cuando se añadió sulfuro (30 µM) a las células adaptadas al sulfuro durante la respiración con metanol, el consumo de O2 disminuyó ~3 veces (Fig. 5 complementaria). Las tasas de respiración restantes (66 μmol O2 · min−1 · g DW−1) fueron más altas de lo esperado a partir de la tasa máxima de respiración de H2S (dependiente de SITO) (53 ± 4 μmol O2 · min−1 · g DW−1), lo que indica que todavía se respiraba al menos algo de metanol, lo que se confirmó por el hecho de que la tasa de producción de CO2 continuó entre 20 y 30 % en presencia de sulfuro. Por el contrario, a las mismas concentraciones de H2S, la respiración de CH4 había cesado casi por completo (Fig. 2).

a Cese del consumo de H2S por células no adaptadas tras la adición de metanol (concentración final 0,4 mM). b Inhibición del consumo de H2S por células adaptadas al sulfuro después de la adición de metanol (concentración final 5 mM). Los números indican las tasas de consumo en μmol H2S · min−1 · g DW−1. La línea horizontal negra indica un breve momento de anoxia para demostrar que la oxidación del H2S depende del O2. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

La adición de H2S a las células no adaptadas que consumen H2 disminuyó la tasa de consumo de H2 en un 30 %, mientras que el consumo de H2S solo comenzó después del agotamiento completo de H2 (Fig. 4). Además, la respiración de H2 fue hasta dos veces mayor que la respiración de H2S después de que se agotó todo el H2. De manera similar, la oxidación de H2S a 20-40 μM de H2S se redujo en aproximadamente un 80 % al agregar ácido fórmico (CHOOH) 200 μM (Fig. 6 complementaria), mientras que la tasa de respiración total aumentó en un 15 %. La observación de que el H2S solo se oxida después de que el H2 (o el metanol) se ha agotado (Fig. 4) sugiere vías competitivas de transferencia de electrones a la oxidasa terminal insensible al sulfuro (SITO) debido a su capacidad de respiración limitada. Curiosamente, cuando en un experimento separado se oxidó H2S 1,2 mM como única fuente de energía durante ~3 h y se detuvieron las adiciones de O2, se produjo H2S en condiciones anóxicas (Fig. 7 complementaria). Posiblemente, la cepa SolV está utilizando una enzima productora de sulfuro, reduciendo los polisulfuros y/o el azufre elemental (S0) producidos hasta ahora. Por el contrario, el H2 no se consumió en ausencia de polisulfuros y/o azufre elemental en condiciones anóxicas, lo que indica que estos compuestos de azufre y no el sulfato presente en el medio se utilizaron como aceptores de electrones. La producción de H2S se estimuló hasta 13 μmol H2S · min−1 · g DW−1 cuando había H2 o metanol como donante de electrones.

Los números verdes indican las tasas de consumo de H2 en μmol · min−1 · g DW−1 antes y después de la adición de H2S, respectivamente. El número y la línea rojos indican la tasa de consumo de H2S en μmol · min−1 · g DW−1 después del agotamiento de H2. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

La cinética de oxidación de H2S por células adaptadas al sulfuro se estudió utilizando un cromatógrafo de gases, que tiene un límite de detección más bajo que el MIMS. A partir de 3,5 μM H2S y 190 μM O2, se observó una disminución casi lineal hasta 1 μM H2S con una tasa de 167–223 μmol H2S · min−1 · g DW−1 (Fig. 5a). Estas tasas son ligeramente más altas que las tasas máximas de conversión de H2S medidas en la cámara MIMS a 5–30 μM H2S y 60–80 μM O2 (Tabla 1), lo que podría explicarse por las concentraciones más altas de O2 y bajas de H2S presentes en las incubaciones utilizadas para mediciones de GC. Debido a que el O2 y el H2S compiten por la oxidasa terminal sensible al sulfuro (SSTO), una concentración baja de H2S y alta de O2 alivia la inhibición de la SSTO, lo que conduce a tasas más altas de consumo de H2S. El modelo de Michaelis-Menten del consumo de H2S dio como resultado una constante de afinidad aparente Ks de 0,32 μM de H2S. Sin embargo, las trazas de H2S por debajo de 1 μM de H2S no siguieron la curva predicha y permanecieron ligeramente por encima de ella (Fig. 5a). Cuando en la cámara MIMS se siguió el consumo de O2 hasta cero a concentraciones de H2S de 15–20 μM, se determinó una constante de afinidad aparente Ks de 0,14 ± 0,01 μM O2 que sigue la cinética de Michaelis-Menten (Fig. 5b). En presencia de H2S 15 μM, SITO no se inhibió ya que se midieron tasas de consumo de O2 idénticas después de la adición secuencial de O2 (Fig. 8 complementaria). Suponiendo que solo un tipo de oxidasa terminal sea activo en estas condiciones y que la conversión de H2S no sea el factor limitante, una Ks de 0,14 ± 0,01 μM O2 podría ser un valor fiable para la oxidasa terminal insensible a los sulfuros.

una oxidación de H2S medida por cromatografía de gases. Diferentes diamantes sombreados en azul representan réplicas biológicas (n = 3). La reacción se inició mediante la adición de células después de 33 min. b Respiración de H2S medida a través de un punto de sensor de oxígeno de fibra óptica en la cámara MIMS. Las líneas negras indican el ajuste de la curva de Michaelis-Menten. La reacción se inició mediante la adición de células a los 0 min. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para evaluar cómo las células SolV de M. fumariolicum se adaptan al H2S, se extrajo el ARNm del quimiostato dual H2S-CH4 (células adaptadas al sulfuro) y el quimiostato CH4 (células no adaptadas), ambos en estado estacionario, y se cuantificó la expresión génica ( Tabla 2, Fig. 9 complementaria, Datos complementarios 1). En células adaptadas a sulfuro, el operón MFUM_v2_0219-21 se reguló aproximadamente 1,7 veces. Los genes en este operón están anotados como deshidrogenasa dependiente de NAD (FAD) (MFUM_v2_0219), una proteína homóloga a la proteína transportadora de azufre TusA (MFUM_v2_0220) y una proteína transportadora de azufre putativa DsrE2 (MFUM_v2_0221), respectivamente. Una investigación más detallada reveló que MFUM_v2_0219 codifica una sulfuro:quinona oxidorreductasa (SQR)44 de tipo III. Según las comparaciones de genes, un segundo gen (MFUM_v2_0138) podría codificar un SQR, aunque este gen no se reguló significativamente en presencia de H2S y se transcribió en un grado mucho menor que MFUM_v2_0219 en células adaptadas a sulfuro (Datos complementarios 1). Se transcribieron dos genes (MFUM_v2_0873 y MFUM_v2_1149) que podrían codificar dioxigenasas de azufre, que supuestamente podrían oxidar el azufre elemental a sulfito (SO32-) (Datos complementarios 1). Además, los genes MFUM_v2_0942 y MFUM_v2_0943 aumentaron 2 y 8 veces (Tabla 2) y muestran una gran similitud con los genes que codifican la proteína SorB del citocromo c y la sulfito:citocromo c oxidorreductasa SorA de Thiobacillus novellus, respectivamente45. En células adaptadas a sulfuro, la supuesta dioxigenasa de azufre (MFUM_v2_0873) se transcribió en un grado similar al SQR (MFUM_v2_0219). Sin embargo, según la estequiometría de 1 H2S: 0,48 O2 (± 0,005; n = 3) cuantificada en la cámara MIMS, se cree que la conversión de azufre elemental y polisulfuros a través de sulfito a sulfato tiene un papel menor en las condiciones probadas. Además, la oxidación de H2S nunca estuvo acompañada por una disminución del pH, lo que habría ocurrido si el azufre elemental se hubiera oxidado más a tiosulfato, sulfito o sulfato. El operón MFUM_v2_1257-61 codifica una citocromo c oxidasa de tipo ba3 que se incrementó ~5 veces en presencia de H2S, de acuerdo con la tasa de respiración SITO 5 veces mayor en células adaptadas a sulfuro. Curiosamente, el gen regulado al alza más alto (15 veces) codifica una proteína de citocromo c de heptahema de 89 kDa de función desconocida (MFUM_v2_1950), que muestra la mayor similitud con los genes que se encuentran en los oxidantes de sulfuro termófilos. En presencia de H2S, varios genes que codifican enzimas involucradas en la biosíntesis de sulfuro para la producción de metabolitos que contienen azufre (p. ej., cisteína, metionina y glutatión) se redujeron fuertemente (Tabla 2). Además, se observó la regulación a la baja de genes implicados en la oxidación de CH4 y la posterior transferencia de electrones en la cadena respiratoria (Tabla 2). Esta regulación a la baja está de acuerdo con las tasas máximas de conversión de metano y de respiración disminuidas medidas.

La observación de que M. fumariolicum SolV posee un SQR y el hecho de que CH4 y H2S coexistan en una gran variedad de ambientes nos llevó a investigar la presencia de SQR en metanótrofos. De hecho, los genes que codifican SQR putativos también están muy extendidos en los metanótrofos proteobacterianos de diversos entornos, como lagos, humedales, rizosfera, sedimentos oceánicos, suelos de permafrost, arrozales, plantas de tratamiento de aguas residuales, lagos de soda alcalina, vertederos y acuíferos de aguas subterráneas (Fig. 10 complementaria) . Los SQR se clasifican en seis tipos diferentes en función de su estructura y difieren en su afinidad por el H2S y su función fisiológica en la célula44. Se detectaron SQR putativos en una gran variedad de géneros de proteobacterias en los que estaba presente un pMMO y/o sMMO, como Crenothrix, Methylobacter, Methylolocaldum, Methylocapsa, Methylococcus, Methylocystis, Methylohalobius, Methylomagnum, Methylomarinum, Methylomicrobium, Methylomonas, Methyloprofundus, Methylosinus, Methylospira, Methyloterricola, Methylotetracoccus, Methylotuvimicrobium y Methylovulum (Fig. 10 complementaria). Además, la cepa HY1 de la alfaproteobacterium 'Methylovirgula thiovorans' recientemente aislada codifica un tipo I SQR40. Por el contrario, los metanótrofos verrucomicrobianos poseen genes que codifican un SQR de tipo III, que comprende SQR bacterianos y arqueales, de los cuales se conoce menos44.

En este estudio mostramos por primera vez que un microorganismo puede oxidar CH4 y H2S simultáneamente, y que un metanótrofo puede producir biomasa a partir de CO2 con H2S como única fuente de energía. Mostramos que la oxidación de H2S es necesaria porque el H2S inhibe tanto la respiración como la oxidación de CH4. Las células respondieron a la presencia de H2S mediante la regulación al alza de una sulfuro:quinona oxidorreductasa (SQR) de tipo III y una oxidasa terminal de tipo ba3 insensible al sulfuro (SITO). Además, proporcionamos evidencia de un mecanismo de desintoxicación de H2S en los metanótrofos que, según la información genómica y la coexistencia de metano y sulfuro en una miríada de entornos, parece estar muy extendido.

Se sabe muy poco sobre el efecto del H2S en la metanotrofia. Un consorcio metanotrófico muestreado de un vertedero mostró una actividad metanotrófica disminuida en presencia de H2S46. Además, la oxidación de CH4 por Mthylocaldum sp. SAD2, aislado de un digestor anaerobio rico en sulfuro, se inhibió significativamente (disminución del 44-60 % en la producción de metanol) en presencia de 0,1 % de H2S, pero no se exploró el mecanismo47,48. Recientemente se demostró que la cepa HY1A de 'Methylovirgula thiovorans' es capaz de consumir varios compuestos reducidos de azufre junto con CH4, pero no se pudo observar la oxidación simultánea de CH4 y H2S40. En la turbera donde se aisló la cepa HY1A, la concentración de H2S estaba por debajo del límite de detección, lo que sugiere que podría no ser necesaria una desintoxicación vigorosa de H2S. En contraste, los ambientes geotérmicos donde residen M. fumariolicum SolV y otros metanótrofos verrucomicrobianos, se caracterizan por altas concentraciones de H2S (desde <50 ppm hasta 20000 ppm)28,35,49. En consecuencia, la capacidad demostrada para fijar CO2 con H2S como única fuente de energía y oxidar eficientemente H2S a S0 podría ser muy ventajosa en sistemas tan hostiles. Teniendo en cuenta que en el medio natural coexisten múltiples sustratos, se espera que un estilo de vida mixotrófico, en el que se utilicen simultáneamente CH4, H2 y H2S, sea más beneficioso32,50.

Se sabe que el H2S se une a metales como el cobre y el hierro, lo que podría conducir a la inhibición de la capacidad de oxidación de CH4 de los pMMO dependientes de cobre y las oxidasas terminales involucradas en la reducción de O21,4,5,6,51,52. Curiosamente, la cepa HY1A de 'Methylovirgula thiovorans' solo codifica un sMMO40 dependiente de hierro, mientras que M. fumariolicum SolV codifica tres pMMO16 dependientes de cobre. La primera cepa no oxida simultáneamente H2S y CH4, mientras que la última tiene un sistema de desintoxicación rápida de H2S para aliviar la inhibición de la metanotrofia. Por lo tanto, la medida en que el H2S inhibe un tipo de metano monooxigenasa podría influir en la necesidad de un sistema de desintoxicación de H2S. Debido a que en M. fumariolicum SolV, el gen que codifica un SQR de tipo III se reguló positivamente en presencia de H2S, proponemos que esta enzima es responsable de la oxidación observada de H2S a azufre elemental. De hecho, se demostró que los SQR de tipo III acoplan la oxidación de H2S a la reducción de quinonas en varias arqueas y bacterias53,54. En metanótrofos verrucomicrobianos, se encuentran tres tipos diferentes de oxidasas terminales: un tipo aa3, un tipo ba3 y un tipo cbb316. La posesión de múltiples tipos de oxidasas terminales permite una cadena de transporte de electrones ramificada, lo cual es muy ventajoso en entornos con condiciones fluctuantes y disponibilidad variable de sustrato y oxígeno. Mediante estudios de respiración, demostramos que M. fumariolicum SolV posee una o más oxidasas terminales sensibles a los sulfuros (SSTO) y al menos una oxidasa terminal insensible a los sulfuros (SITO). Debido a que una oxidasa terminal de tipo ba3 está fuertemente regulada al alza en células que crecen con altas cargas de H2S, proponemos que este complejo enzimático específico sea el SITO dedicado en metanótrofos verrucomicrobianos. De manera similar, en células cultivadas con azufre de Acidithiobacillus ferrooxidans, esta oxidasa de tipo ba3 estaba regulada al alza55. La proteína citocromo c heptahemor altamente regulada (MFUM_v2_1950) en M. fumariolicum SolV podría estar involucrada como transportador de electrones desde SQR a la cadena de transporte de electrones. Este transportador de electrones putativo podría explicar por qué la respiración de H2S aún continúa parcialmente tras la adición de metanol en las células adaptadas al sulfuro y no en las células no adaptadas. En este último, la falta de este transportador de electrones putativo de heptahem podría ser el factor limitante para la respiración de H2S, siendo invalidado por las cantidades relativamente grandes del transportador de electrones XoxGJ, que media la transferencia de electrones del metanol a la oxidasa terminal56. Por el contrario, en las células no adaptadas, la proporción en las transcripciones de los genes que codifican XoxGJ y el supuesto portador de electrones del heptahema es de 27,6 en comparación con 1,2 en las células adaptadas al sulfuro. En consecuencia, la regulación positiva del gen que codifica el transportador de electrones heptahem puede permitir que la respiración de sulfuro ocurra simultáneamente con la oxidación de metanol, usando la misma oxidasa terminal. El H2S impide tanto el SSTO como la reacción catalizada por pMMO, ya que a 10 μM de H2S la conversión de CH4 se inactivó casi por completo, mientras que la conversión de metanol, formiato y H2 aún podía continuar. La disminución observada en la conversión de CH4 en el quimiostato con una carga máxima de H2S de 156 μmol H2S · min−1 · g DW−1 (concentración líquida <40 nM) fue más de lo que se puede esperar de nuestros estudios de inhibición de la conversión de metano y puede indicar que una gran parte de la cadena respiratoria se utiliza para los electrones generados por la oxidación de H2S, lo que da como resultado un conjunto de Q demasiado reducido que impide el funcionamiento adecuado del complejo alternativo III (ACIII). La oxidación de H2S es necesaria para mantener esta molécula en concentraciones bajas y no inhibidoras. En consecuencia, los electrones liberados de esta oxidación deben ser procesados ​​por la cadena de transporte de electrones, lo que lleva a la competencia de sustratos durante la oxidación simultánea de múltiples compuestos como H2S y CH4. De manera similar, se propuso que un SQR hiperactivo en Rhodobacter capsulatus podría conducir a una reducción excesiva del grupo de quinonas57. La oxidasa de tipo ba3 regulada al alza puede aliviar este problema al oxidar el quinol y reducir el aceptor terminal de electrones O2. En Aquifex aeolicus, se encontró una oxidasa de tipo ba3 relacionada en un supercomplejo con SQR58. Se demostró que esta oxidasa terminal no solo oxida el citocromo c reducido, sino también el ubiquinol directamente59. En la cepa SolV puede haber un papel importante para la proteína heptahem, altamente regulada al alza, como un transbordador de electrones dedicado entre el ACIII que acepta quinonas y la oxidasa de tipo ba3. Una cadena ramificada de transporte de electrones con diferentes oxidasas terminales permite adaptaciones y versatilidad metabólica. Por ejemplo, E. coli utiliza la oxidasa de tipo bo3 que bombea protones durante el crecimiento, pero requiere oxidasas de tipo bd insensibles a los sulfuros para seguir creciendo en presencia de H2S60. Curiosamente, hay dos genes presentes que podrían codificar dioxigenasas de azufre (MFUM_v2_0873 y MFUM_v2_1149) para oxidar aún más el azufre elemental. Sin embargo, la estequiometría medida de 1 H2S a 0,48 O2, la producción de azufre elemental y la ausencia de producción de ácido muestran claramente que el H2S no se oxida más en un grado significativo. Queda por investigar si los metanótrofos pueden oxidar el H2S a sulfito y sulfato.

Se demostró que las células de M. fumariolicum SolV oxidan rápidamente el H2S con una constante de afinidad aparente baja (es decir, alta afinidad) por debajo de 1 μM de H2S. Los valores cinéticos observados no sorprenden, ya que el H2S ya inhibe la metanotrofia a concentraciones tan bajas. A través de la cromatografía de gases, no se pudo determinar una constante de afinidad aparente exacta para las células enteras, ya que el consumo de H2S no siguió una curva típica de Michaelis-Menten. Una limitación de la capacidad respiratoria para la oxidación de H2S por encima de aproximadamente 1 μM puede explicar tal desviación y podría resolverse mediante la purificación de SQR. La observación de que M. fumariolicum SolV redujo el azufre elemental o los polisulfuros a H2S en presencia de H2 o metanol es intrigante. La cepa HY1A de 'Methylovirgula thiovorans' cultivada en tiosulfato produjo cada vez más una enzima que se asemeja a una proteína conocida por poseer actividad sulfhidrogenasa40. Curiosamente, esta enzima se agrupa con la hidrogenasa del grupo 3b [NiFe] de M. fumariolicum SolV, que se cree que está involucrada en la producción de NAD(P)H para la fijación de CO250. De hecho, se propone que estas hidrogenasas pueden tener actividad sulfhidrogenasa, lo que podría ser un mecanismo para disponer de equivalentes reductores61,62. Por lo tanto, la hidrogenasa del grupo 3b [NiFe] de M. fumariolicum SolV podría ser responsable de la conversión de S0 a H2S. El cultivo en quimiostatos nuevamente resultó ser una herramienta muy poderosa para investigar el metabolismo de los metanótrofos41,63. A través de la adaptación, M. fumariolicum SolV pudo respirar H2S a una velocidad cinco veces mayor que las células no adaptadas, presumiblemente debido a la regulación positiva de SQR y la oxidasa terminal de tipo ba3.

Los metanótrofos verrucomicrobianos que prosperan en entornos geotérmicos poseen un mecanismo claro para hacer frente al H2S. En consecuencia, SQR y una oxidasa terminal insensible a los sulfuros podrían permitir que estos metanótrofos prosperen en entornos ricos en H2S. De hecho, la pirosecuenciación mostró que las secuencias del gen 16 S rRNA relacionado con Methylacidimicrobium estaban abundantemente presentes en la corona de las tuberías de alcantarillado de hormigón ricas en CH4 y H2S64. Con respecto a los metanótrofos proteobacterianos, el efecto del H2S justifica una mayor investigación. Debido a que los metanótrofos aeróbicos viven en entornos en los que el H2S suele estar presente, proponemos que el mecanismo de desintoxicación de H2S está muy extendido en los metanótrofos de varios entornos.

El Methylacidiphilum fumariolicum SolV utilizado en este estudio se aisló de una olla de barro de la Solfatara cerca de Nápoles, Italia28. El genoma de esta cepa está disponible públicamente y accesible en Genoscope [https://mage.genoscope.cns.fr/microscope/mage/viewer.php?O_id=1176], así como en EMBL/NCBI (BioProject PRJEA85607; acceso ERS14853105). Este entorno se caracteriza por grandes emisiones de sulfuro, altas temperaturas y valores de pH extremadamente bajos. El medio de cultivo estaba compuesto por MgCl2 0,2 ​​mM, CaCl2 0,2 ​​mM, Na2SO4 1 mM, K2SO4 2 mM, (NH4)2SO4 7,5 mM y NaH2PO4 1 mM y oligoelementos en concentraciones finales de NiCl2 1 μM, CoCl2 1 μM, MoO4Na2 1 μM , ZnSO4 1 μM, CeCl3 1 μM, MnCl2 5 μM, FeSO4 5 μM, CuSO4 10 μM y ácido nitrilotriacético (NTA) 40–50 μM. Las células se cultivaron como un cultivo continuo limitado en metano a 55 °C como se describió antes65, excepto que el pH se reguló entre 2,5 y 3,0, que se usó un quimiostato pequeño de 400 ml con el medio como se describió anteriormente y que no se complementó con H2. La concentración de oxígeno se reguló al 1% de saturación de aire. Además, se hizo funcionar un segundo quimiostato en condiciones similares, pero al que se le añadió H2S a través de una entrada de gas adicional (Fig. 1 complementaria). El H2S se produjo mezclando Na2S anóxico 100 mM y HCl 210 mM en una botella de 50 ml con una bomba peristáltica. La corriente de gas de argón/CO2 (95%/5%, v/v) al reactor se condujo a través de esta botella. Para determinar la tasa máxima de conversión de H2S del quimiostato, las células se expusieron gradualmente a concentraciones más altas de H2S mediante la regulación de la bomba peristáltica. Las concentraciones de H2S en la entrada y salida de gas se determinaron mediante cromatografía de gases (descrita en la subsección: Incubaciones discontinuas y cromatografía de gases). Debido a que el H2S se suministró a través de la entrada de gas y, por lo tanto, debe transferirse a la fase líquida, la concentración de H2S líquido será cercana o inferior a su concentración de equilibrio, que a 55 °C es 1,6 veces la concentración de gas (calculada a partir de la ecuación de Ostwald). coeficiente a 55 °C)66. Además, para observar si M. fumariolicum SolV puede crecer en H2S como única fuente de energía, se operó un cultivo discontinuo alimentado en la misma configuración que el sistema quimiostático. En este caso, se detuvo el flujo medio y se cambió el gas argón/CO2 por una corriente de gas solo argón. Al mismo tiempo, se agregaron cantidades iguales de una solución de bicarbonato marcada con 13C (50 mM) y una solución de HCl (100 mM) a la botella mezcladora de sulfuro, creando una concentración de gas 13C-CO2 de aproximadamente 2%. Se recogieron muestras de biomasa de 5 ml del cultivo discontinuo alimentado mediante centrifugación durante varios días y los gránulos se lavaron con agua acidificada (pH 3). Luego, los sedimentos se resuspendieron en pequeñas cantidades de agua acidificada y, posteriormente, las muestras se pipetearon en vasos de hojalata y se secaron durante la noche a 70 °C al vacío. La incorporación de 13CO2 a la biomasa se evaluó midiendo la relación 13/12C utilizando un espectrómetro de masas de relación isotópica (IR-MS) Finnigan DeltaPlus, como se describió anteriormente42.

Para medir con precisión los gases disueltos, se realizó espectrometría de masas de entrada de membrana (MIMS) como se describió anteriormente65, excepto que se utilizó una cámara MIMS de 30 ml. Todas las velocidades se midieron a 52 °C. La sonda insertada consistía en un tubo de acero inoxidable de extremo romo (diámetro 3 mm) perforado con 4 a 16 orificios de 1 mm de diámetro. Los orificios se cubrieron con tubos de silicona (Silastic, 50VMQ Q7-4750 Dow Corning, suministrado por Freudenberg Medical a través de VWR International, 1,96 mm de diámetro exterior x 1,47 mm de diámetro interior). Para facilitar el montaje, el tubo de silicona se empapó brevemente en hexano, que hace que la silicona se hinche. La pieza metálica se humedeció con isopropanol como lubricante. La sonda se conectó directamente a través de un tubo de acero inoxidable de 1/8 o 1/16 de pulgada al MS que funcionaba con una corriente de emisión de 40 μA. El medio con un pH igual al del cultivo (pH 2,5–3,0) agregado a la cámara se enjuagó primero con 3 % de CO2 en gas argón, después de lo cual la concentración de oxígeno se ajustó al valor deseado agregando oxígeno puro o aire a través del espacio de cabeza Tanto la masa 15 como la 16 son masas dominantes para el CH4 en el espectrómetro de masas, pero la masa 15 tiene una señal de fondo mucho más baja que la masa 16 y, por lo tanto, se eligió para medir el CH4. Se añadieron metano e hidrógeno (masa 2) como gas en el espacio de cabeza o, en el caso de la calibración, a partir de una solución madre saturada. Estas soluciones madre se prepararon en una botella cerrada con agua a temperatura ambiente y un espacio de cabeza de gas puro con presión conocida. Para la solubilidad en agua se tomó 1,47 mM y 0,80 mM para metano e hidrógeno, respectivamente (a 22 °C y 1 bar)66. Cuando se iban a medir las tasas de producción de CO2, se añadieron cantidades equimolares de ácido sulfúrico y bicarbonato de 13C después de lavar con argón. De esta manera, la fijación de CO2 que ocurre simultáneamente proviene principalmente del CO2 marcado con 13C (masa 45), lo que genera una menor interferencia con la medición de la producción de CO2. Al principio, el CO2 sin etiquetar (masa 44) era muy bajo y su aumento reflejaba casi exclusivamente la producción de CO2 a partir de metano o metanol sin etiquetar.

La estequiometría de la oxidación de H2S se determinó mediante la adición de pulsos de una solución madre de sulfuro y O2 (como pequeñas burbujas de gas con una jeringa) para mantener bajas las concentraciones en 1–20 μM H2S y 0–5 μM O2. En total, se agregaron 0,7 a 1,4 mM de Na2S durante un período de 1,5 a 3 h. Durante este experimento, se añadieron simultáneamente cantidades equimolares de una solución madre de ácido sulfúrico 200 mM para limitar el cambio de pH dentro de 0,2 unidades. La concentración de oxígeno se midió simultáneamente en la cámara MIMS por medio de un sensor de oxígeno de fibra óptica (TROXSP5, PyroScience, Aachen, Alemania) que estaba pegado en el interior de la cámara. Estos puntos podrían medir hasta aproximadamente 20 nM de oxígeno, que es mucho más bajo de lo que se puede medir con la señal de masa 32 de MIMS.

Para determinar los parámetros cinéticos de oxidación de H2S por células adaptadas al sulfuro, se realizaron incubaciones por lotes en botellas de suero de 120 ml que contenían 10 ml de medio sin elementos traza. Se omitieron elementos traza para minimizar el efecto de la oxidación de sulfuro abiótico. Los frascos se cerraron con tapones de goma de butilo. Las incubaciones se realizaron a 55 °C y 350 rpm. El H2S se preparó mezclando Na2S con HCl en una botella cerrada. Se tomó un volumen de espacio de cabeza y se inyectó en botellas de suero de 120 ml y se equilibró durante 30 min antes de iniciar el ensayo mediante la adición de células. El H2S se midió inyectando 100 μL del espacio de cabeza de las botellas con una jeringa de vidrio Hamilton en un GC (7890B GC Systems Agilent Technologies, Santa Clara, EE. UU.) equipado con una columna de vidrio Carbopack BHT100 (2 m, DI 2 mm) y un detector fotométrico de llama (FPD). Las áreas obtenidas se usaron para calcular las cantidades de H2S usando curvas estándar de calibración con H2S. Brevemente, se acidificaron 400 μL de una reserva de Na2S 25 mM (sulfuro de sodio nonahidratado, pureza >98 %, Sigma-Aldrich) con 2 mL de HCl 0,5 M en una botella de 574 mL creando una concentración de espacio de cabeza de 17,4 nmol · mL−1. Posteriormente, se agregaron pequeños volúmenes del espacio de cabeza a una botella de 1162 ml para crear varias concentraciones de H2S que se inyectarán (0,1 ml) en el GC para la calibración. La curva de calibración osciló entre ~1 nmol · L−1 y 1 μmol · L−1 H2S.

Para cada réplica, se tomaron muestras de 10 ml del quimiostato y las células se sedimentaron inmediatamente durante 3 min a 15 000 × g, se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a –80 °C. Las células se recogieron de cultivos en estado estacionario, lo que corresponde a parámetros constantes durante al menos 5 cambios de volumen del reactor. El ARN total se aisló utilizando el kit de purificación de ARN RiboPure™ para bacterias (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ARN ribosómico se eliminó de las muestras de ARN total para enriquecer el ARNm utilizando el kit de enriquecimiento de ARNm bacteriano MICROBExpress™ (Thermo Fisher Scientific) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se utilizaron el kit de ensayo HS de ARN Qubit™ (Thermo Fisher Scientific) y el kit Nano RNA 6000 de Agilent (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania) y los protocolos para el análisis cuantitativo y cualitativo del ARN total extraído y el ARNm enriquecido. Este último se utilizó para la preparación de bibliotecas mediante la Guía de referencia de ARNm de cadena TruSeq (Illumina, San Diego, CA, EE. UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para la evaluación cuantitativa y cualitativa del cDNA sintetizado, se utilizaron el kit Qubit™ dsDNA HS (Thermo Fisher Scientific) y el kit Agilent High Sensitivity DNA (Agilent Technologies) y los protocolos. Se verificó la calidad de las lecturas del transcriptoma mediante FastQC67 y, posteriormente, se recortaron 10 pares de bases en el extremo 5' y 5 pares de bases en el extremo 3' de cada lectura. Las lecturas se mapearon contra el genoma completo de M. fumariolicum SolV (número de acceso LM997411)68 utilizando Bowtie269. El resto del análisis y la producción de imágenes se realizó en la versión 4.0.2 del entorno R70. Los recuentos de lectura mapeados por gen se determinaron utilizando Rsubread71 y el cambio de pliegue y la dispersión se estimaron utilizando DEseq272. Antes de hacer cualquier estadística, se realizó un análisis de componentes principales en los 1000 genes principales por varianza de cada muestra para verificar si las muestras dentro de la misma condición eran similares a cada muestra parte de la misma condición y diferentes a cualquier otra muestra. Para la expresión diferencial, DEseq2 empleó una prueba de Wald para calcular los valores de p ajustados. Se consideró que las diferencias en los recuentos eran significativas si la media base era >4, el cambio de log2 veces era superior a [0,58] y el valor de p ajustado era ≤0,05. Para facilitar las comparaciones entre muestras, se calcularon los valores de TPM (transcripciones por millón de kilobases).

Las concentraciones de carbono orgánico total (TOC) de los cultivos se determinaron usando un analizador TOC-L CPH/CPN (Shimadzu, Duisburg, Alemania). Las muestras se diluyeron tres veces en agua Milli-Q antes de las mediciones y, posteriormente, se rociaron con ozono durante 20 minutos mientras se agitaba para eliminar el CO2 del líquido. No fue necesaria la acidificación de las soluciones debido al bajo pH de las muestras. Una densidad óptica de 1 medida a 600 nm equivale a ~450 mg de peso seco (DW) por litro.

Todas las secuencias genómicas disponibles de metilotrofos conocidos de los órdenes Methylococcales (Gammaproteobacteria) y Methylacidiphilales (Verrucomicrobia), las familias Methylocystaceae y Beijerinckia (Alphaproteobacteria) y el género Methylomirabilis se recuperaron de la base de datos del NCBI. Los genomas de los metanótrofos se seleccionaron mediante la explosión de secuencias de aminoácidos de PmoA de Methylococcus capsulatus (acceso Q607G3 de SwissProt) y sMMO de Methylosinus acidophilus (acceso de NCBI AAY83388.1) con un umbral de valor e de 10−3 y un umbral de %-id de > 30%. Los genomas que contenían una secuencia de metano monooxigenasa se extrajeron posteriormente en busca de supuestas secuencias SQR mediante la voladura de una secuencia representativa de cada uno de los subtipos de SQR según lo definido por investigaciones previas44: tipo I, WP_010961392.1; tipo II, WP_011001489.1; tipo III, WP_009059890.1; tipo IV, WP_011372252.1; tipo V, WP_012502121.1; tipo VI, WP_011439951.1. Las supuestas secuencias SQR se alinearon con las del árbol filogenético de 44 utilizando Muscle 3.8.155173 con la configuración predeterminada. Se construyó un árbol filogenético de máxima verosimilitud con 500 réplicas de arranque utilizando RAxML 8.2.1074 utilizando la opción de arranque rápido y el modelo de sustitución de aminoácidos LG75. El árbol final se visualizó usando MEGA7 y el clado de secuencias de sulfuro deshidrogenasa de flavocitocromo c (FCSD) se usó como grupo externo.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de secuenciación de ARN en este estudio se han depositado en la base de datos NCBI con el número de acceso PRJNA766544. El genoma de Methylacidiphilum fumariolicum SolV se ha depositado en la base de datos del NCBI con el número de registro ERS14853105. Los datos complementarios 1 y el archivo de datos de origen también están disponibles en figshare (https://doi.org/10.6084/m9.figshare.22779005). Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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RAS, SSM, TB y HJMOdC recibieron el apoyo del Consejo Europeo de Investigación (ERC Advanced Grant project VOLCANO 669371), MSMJ recibió el apoyo del European Research Council (ERC Advanced Grant project EcoMoM 339880), WV recibió el apoyo de la Organización Holandesa para la Investigación Científica La subvención de investigación (NWO) VI.Vidi.192.001 y SHP fue apoyada por la subvención ALWOP.308 de la Organización Holandesa para la Investigación Científica (NWO). Queremos agradecer a la Dra. Marianne Guiral y al Dr. Frauke Baymann (CNRS, Universidad de Aix-Marseille, Marsella, Francia) por sus fructíferos debates. Las infraestructuras nacionales de LABGeM (CEA/Genoscope & CNRS UMR8030), France Génomique y French Bioinformatics Institute (financiadas como parte del programa Investissement d'Avenir gestionado por Agence Nationale pour la Recherche, contratos ANR-10-INBS-09 y ANR-11 -INBS-0013) son reconocidos por soporte dentro de la plataforma de anotación de MicroScope.

Rob A Schmitz

Dirección actual: Instituto de Biogeoquímica y Dinámica de Contaminantes, Departamento de Ciencias de Sistemas Ambientales, ETH Zurich, 8092, Zurich, Suiza

Departamento de Microbiología, Instituto Radboud de Ciencias Biológicas y Ambientales, Universidad Radboud, Heyendaalseweg 135, 6525AJ, Nijmegen, Países Bajos

Rob A. Schmitz, Stijn H. Peeters, Sepehr S. ​​Mohammadi, Tom Berben, Timo van Erven, Carmen A. Iosif, Theo van Alen, Wouter Versantvoort, Mike SM Jetten, Huub JM Op den Camp & Arjan Pol

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RAS, SSM, AP y HJMOdC diseñaron el proyecto y los experimentos. RAS, SSM, TvE, CAI, TvA, WV y AP realizaron los experimentos. TB realizó análisis filogenéticos. RAS, SHP, SSM, TvE, CAI y AP realizaron análisis de datos. RAS, MSMJ, HJMOdC y AP escribieron el manuscrito. RAS, MSMJ, HJMOdC y AP supervisaron la investigación.

Correspondencia a Huub JM Op den Camp.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Christiane Dahl y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Schmitz, RA, Peeters, SH, Mohammadi, SS et al. Oxidación simultánea de sulfuro y metano por un extremófilo. Nat Comun 14, 2974 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38699-9

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Recibido: 04 enero 2023

Aceptado: 11 de mayo de 2023

Publicado: 23 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-38699-9

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